Kultur Jaringan Tanaman

KULTUR JARINGAN A. Pengertian Kultur jaringan Kultur jaringan bila diartikan ke dalam Bahasa Jerman disebut Gewebe Kultur, dalam Bahasa Inggris disebut Tissue Culture, dalam Bahasa Belanda disebut weefsel kweek atau weefsel cultuur. Kultur jaringan atau budidaya in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan atauorgan yang serba steril, dalam botolkultur yang sterildan dalam kondisi yang aseptic, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap. Usaha memperoleh suatu individu baru dari satu sel atau jaringan dikenal sebagai kultur sel atau kultur jaringan. Menurut Suryowinoto (1991), kultur jaringan dalam bahasa asing disebut tissue culture. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Jadi, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang memiliki sifat seperti induknya. Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Kultur jaringan termasuk jenis perkembangbiakan vegetatif yang prinsip dasarnya sama dengan menyetek. Bagian tanaman yang akan dikultur (eksplan) dapat diambil dari akar, pucuk, bunga, meristem, serbuk sari. B. MANFAAT KULTUR JARINGAN 1. Untuk memperbanyak tanaman secara vegetatif dan secara cepat, terutama bagi tanaman yang sulit dibiakkan secara vegetatif (anggrek, pisang) yang mempunyai nilai tinggi 2. Untuk pemuliaan tanaman, yaitu untuk menghasilkan jenis- jenis tanaman baru. Tehnik ini dikenal pula sebagai genetic engineering yaitu menyatukan dua sel yang berbeda sifatnya. 3. Untuk mempelajari fisiologi tanaman, terutama hubungannnya dengan penyakit tanaman. 4. Untuk mempelajari biokimia tanaman, yaitu untuk memperoleh senyawa metabolit sekunder (nikotin,gosipol, steroid dll). C. Tujuan kultur jaringan 1. Memeroleh bibit tanaman baru yang lebih baik 2. Lebih cepat dabn lebih banyak, dalam waktu yang tidak terlalu lama ddengan anakan yang seragam 3. Memperbanyak tanaman dengan sfat seperti induknya 4. Perbanyakan tanaman denngan teknik ini membuat tanaman bebas dari penyakit karena dilakukan secara aseptic 5. Penggunaan metode ini sangat ekonomis dan komersial Kultur jaringan akan lebih besar keberhasilannya bila menggunakan jaringan meristem. Jaringan meristem adalah jaringan muda, yaitu jaringan yang terdiri dari sel-sel yang selalu membelah, dinding tipis, plasmanya penuh dan vakuolanya kecil-kecil. Kebanyakan orang menggunakan jaringan ini untuk tissue culture. Sebab, jaringan meristem keadaannya selalu membelah, sehingga diperkirakan mempunyai zat hormon yang mengatur pembelahan. D. Jenis – jenis Kultur Jaringan 1. Kultur biji (seed culture), kultur yang bahan tanamnya menggunakan biji atau seedling. 2. Kultur organ (organ culture), merupakan budidaya yang bahan tanamnya menggunakan organ, seperti: ujung akar, pucuk aksilar, tangkai daun, helaian daun, bunga, buah muda, inflorescentia, buku batang, akar dll. 3. Kultur kalus (callus culture), merupakan kultur yang menggunakan jaringan (sekumpulan sel) biasanya berupa jaringan parenkim sebagai bahan eksplannya. 4. Kultur suspensi sel (suspension culture) adalah kultur yang menggunakan media cair dengan pengocokan yang terus menerus menggunakan shaker dan menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan eksplannya, biasanya eksplan yang digunakan berupa kalus atau jaringan meristem. 5. Kultur protoplasma. eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. Protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik). 6. Kultur haploid adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman, yakni: kepalasari/ anther (kultur anther/kultur mikrospora), tepungsari/ pollen (kutur pollen), ovule (kultur ovule), sehingga dapat dihasilkan tanaman haploid. E. Teknik kultur jaringan Teknik kultur jaringan memanfaatkan prinsip perbanyakan tumbuhan secara vegetatif. Teknik kultur jaringan suatu sel atau irisan jaringan tanaman yang sering disebut eksplan secara aseptic( in vitro) diletakkan dan dipelihara dalam medium pada atau cair yang cocok dan dalam keadaan steril. dengan cara demikian sebaian sel pada permukaan irisan tersebut akan mengalami proliferasi dan membentuk kalus. Apabila kalus yang terbentuk dipindahkan kedalam medium diferensiasi yang cocok, maka akan terbentuk tanaman kecil yang lengkap dan disebut planlet. Dengan teknik kultur jaringan ini hanya dari satu irisan kecil suatu jaringan tanaman dapat dihasilkan kalus yang dapat menjadi planlet dalam jumlah yang besar. Menurut Thorpe (1981), ada 3 prinsip utama dalam kultur jaringan: Isolasi bagian tanaman dari tanaman utuh (organ, akar, daun dll, Memelihara bagian tanaman tadi dalam lingkungan yang sesuai dan kondisi kultur yang tepat dan Pemeliharaan dalam kondisi aseptik Pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman ini berdasarkan teori sel seperti yang dikemukakan oleh Schleiden, yaitu bahwa sel mempunyai kemampuan autonom, bahkan mempunyai kemampuan totipotensi. Totipotensi adalah kemampuan setiap sel, darimana saja sel tersebut diambil, apabila diletakkan di lingkungan yang sesuai akan tumbuh menjadi tanaman yang sempurna. Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila syarat-syarat yang diperlukan terpenuhi. F. Syarat-syarat  Pengaturan udara dan pH yang baik.  Pemilihan eksplan sebagai bahan dasar untuk pembentukkan kalus, syarat –syarat tumbuhan eksplan: 1. Jaringan tersebut sedang aktif pertumbuhanya,diharapkan masih terdapat zat tumbuh yang masih aktif sehingga membantu perkembangan jaringan selanjutny 2. Eksplan yang diambil beerasal dari bagian daun, akar, mata tunas, kuncup, ujung batang, dan umbi yang dijaga kelestarinya. 3. Eksplan yang diambil dari bagian yang masih muda (bila ditusuk pisau akan terasa lunak sekali.  Penggunaan medium yang cocok, keadaan yang aseptik dan pengaturan udara yang baik terutama untuk kultur cair.  Pilih bagian tanaman yang masih muda dan mudah tumbuh yaitu bagian meristem, seperti: daun muda, ujung akar, ujung batang, keping biji dan sebagainya. Bila menggunakan embrio bagian bji-biji yang lain sebagai eksplan, yang perlu diperhatikan adalah kemasakan embrio, waktu imbibisi, temperatur dan dormansi.  Semua dilakukan dalam lingkungan yang steril. G. Kelebihan dan Kekurangan Kultur Jaringan Kelebihan:  Sifat identik dengan induknya;  Perbanyakan dalam waktu singkat;  Tidak perlu areal pembibitan yang luas;  Tidak dipengaruhi oleh musim;  Tanaman bebas jamur dan bakteri. Sedangkan kekurangannya:  Bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap hama penyakit dan udara luar;  Bagi orang tertentu, cara kultur jaringan dinilai mahal dan sulit;  Membutuhkan modal investasi awal yang tinggi untuk bangunan (laboratorium khusus), peralatan dan perlengkapan;  Diperlukan persiapan SDM yang handal untuk mengerjakan perbanyakan kultur jaringan agar dapat memperoleh hasil yg memuaskan;  Produk kultur jaringan pada akarnya kurang kokoh. H. Perbedaan Perbanyakan Alami dan Kultur Jaringan Alami Alami Kultur jaringan Nutrisi diperoleh secara alami dari dalam tanah Media terbuat dari nutrisi kimia Tanaman dapat membuat makanannya sendiri (autotrof) Tanaman tidak membuat makanannya sendiri Sumber tanaman harus cukup umur Sumber tanaman sedikit Fotosintesis dengan bantuan matahari Fotosintesis dengan cahaya lampu Ada musim hujan dan kemarau yang tidak terkendali Tidak dipengaruhi musim I. Peralatan Kultur Jaringan Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus untuk scapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit. CARA MEMBUAT MEDIA MS SIAP PAKAI UKURAN 1 LITER Langkah pertama dalam pembuatan media MS adalah siapkan : Bahan : Media MS kemasan untuk 1 liter media. Gula 30 gram Agar 8 gram Larutan aquadest Larutan NaOH 1 N Larutan HCl 1 N Larutan PPM Alat : Gelas ukur ukuran 25 ml, 100 ml dan 1000 ml Backer glass ukuran 500 ml Erlenmeyer ukuran 1000 ml Pengaduk dari gelas Spet / jarum suntik ukuran 1 ml dan 5 ml Hot magnetic stirer Cara kerja : 1. Pertama kali siapkan larutan aquadest sebanyak 250 ml diukur dengan gelas ukur ( gunakan menggunakan gelas ukur ukuran 25 ml dan 100 ml ) kemudian masukkan ke dalam backer glass ukuran 500 ml. Setelah siap lalu masukkan serbuk media MS siap pakai dan kemudian diaduk hingga larut semua ( untuk lebih cepatnya mengaduknya memakai hot magnetic stirer sehingga warna aquadest menjadi agak kekuningan. 2. Setelah media MS dilarutkan kemudian masukkan gula sebanyak 30 gram dan diaduk sampai larut semua dan agar lebih cepat digunakan hot magnetic stirer kalau perlu juga dipanaskan untuk mengaduknya. 3. Langkah selanjutnya pindahkan larutan ini ke dalam erlenmeyer ukuran 1000 ml kemudian tambahkan serbuk agar. 4. Selanjutnya tambahkan larutan aquadest sampai volume mencapai ukuran 1000 ml. 5. Setelah itu masak sampai mendidih dan agar larut semua. 6. Kemudian media yang sudah masak ini ditambahkan larutan PPM ( Plant Preservative Mixture ) dan hormon sesuai dengan kebutuhan. 7. Selanjutnya ukur pH media dengan menggunakan pH stick yang elektric atau menggunakan kertas pH dan diukur pada pH 5,8 sd 6,0 ( karena saat autoclaf pH akan turun ± 0,2 sehingga setelah autoclaf diharapkan pH akan menjadi antara 5,6 sd 5,8 ). 8. Kemudia larutan media dibagi ke dalam botol-botol kultur yang sudah disiapkan dan setelah dimasukkan ke dalam botol kultur lalu botol ditutup dengan rapat menggunakan aluminium foil dan diberi label nama medianya. 9. Masukkan botol-botol kultur yang telah berisi media tersebut ke dalam autoclaf lalu autoclaf ditutup lalu autoclaf dipanaskan sampai pada suhu 121ºC dan tekanan 15 pound per inchi persegi selama 15 menit. 10. Setelah autoclaf selesai tunggu hingga tekanan menjadi 0 dan tunggu sampai autoclaf dingin, setelah dingin autoclaf bisa dibuka dan botol-botol yang berisi media bisa dikeluarkan dan diletakkan di ruang inkubasi pertama ( tempat penyimpanan media ). 11. Tunggu media dalam botol dingin dan menjadi padat dan karena menggunakan PPM maka media sekitar 3 jam atau setelah media dingin dan padat siap untuk digunakan untuk menanam eksplan. J. Metode Pelaksanaan Kultur Jaringan 1. Dilihat dari Macam Media Tanam Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu: a) Metode Padat (Solid Method) Metode pada dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan kemudian dengan medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas sehingga kalus dapat tumbuh menjadi planlet. Media padat adalah media yang mengandung semua komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian dipadatkan dengan menambahkan zat pemadat. Zat pemadat tersebut dapat berupa agar-agar batangan, agar-agar bubuk, atau agar-agar kemasan kaleng yang yang memang khusus digunakan untuk media padat untuk kultur jaringan. Media yang terlalu padat akan mengakibatkan akar sukar tumbuh, sebab akar sulit untuk menembus ke dalam media. Sedangkan media yang terlalu lembek akan menyebabkan kegagalan dalam pekerjaan. Kegagalan dapat berupa tenggelamnya eksplan yang ditanam. Eksplan yang tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi kalus, karena tempat area kalus yaitu pada irisan (jaringan yang luka) tertutup oleh medium. Metode padat dapat digunakan untuk metode kloning, untuk menumbuhkan protoplas stelah diisolasikan, untuk menumbuhkan planlet dari protokormus stelah dipindahkan dari suspensi sel, dan untuk menumbuhkan planlet dari prtoplas yang sudah difusikan (digabungkan). b) Metode Cair(Liquid Metho) Penggunaan metode cair ini kurang praktis dibandingkan dengan metode padat, karena untuk menumbuhkan kalus langsung dari ekspaln sangat sulit sehingga keberhasilannya sangat kecil dan hana tanaman-tanaman tertentu yang dapat berhasil. Oleh karena itu, penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel, yaitu untuk menumbuhkan plb (prtocorm like bodies). Dari protokormus ini nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila dipindahkan kedalam media padat yang sesuai. Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat, karena kita tidak p erlu memanaskannya untuk melarutkan agar-agar. Media cair juga tidak memerlukan zat pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein. 2. Dilihat dari Bahan atau Eksplan yang Dipakai Bila dilihat dari macam bahan yang digunakan, maka metode kultur jaringan yang telah dikenal sekarang antara lain adalah: 1) Kultur meristem. 2) Kultur antera 3) Kultur endosperma 4) Kultur suspensi sel 5) Kultur protoplas 6) Kultur embrio 7) Kultur spora 8) Dan lain-lain 3. Dilihat dari Cara Pemeliharaan Eksplan yang telah ditanam, agar dapat tumbuh menjadi kalus dan kemudian menjadi planlet, membutuhkan pemeliharaan yang rutin dan tepat. Artinya, eksplan atau kalus yang sudah waktunya untuk dipindahkan ke dalam media tanam yang baru harus segera dilaksanakan, tidak boleh sampai terlambat. Pemindahan yang terlambat dapat menyebabkan pertumbuahn eksplan atau kalus dapat terhenti atau dapat mengalami brownig atau terkontaminasi oleh jamur atau bakteri. K. Tahapan Kultur Jaringan Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat pendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Ada dua penggolongan media tumbuh: media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar. Nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan. Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius, karena setiap tahapan pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan tersendiri. Secara umum teknik kultur jaringan terdiri dari lima tahapan, yaitu: tahap persiapan; tahap inisiasi kultur; tahap multiplikasi tunas; tahap pemanjangan tunas, induksi akar dan perkembangan akar; dan tahap aklimatisasi. 1. Tahap Persiapan Tahap persiapan ini meliputi persiapan ruangan, alat-alat yang akan digunakan, bahan tanaman serta media tanam. • Persiapan ruangan dan alat-alat yang akan digunakan merupakan tahap awal dan sangat penting. Faktor yang menentukan keberhasilan teknik kultur jaringan ini adalah tingkat sterilisasi yang tinggi. Ruangan dan alat-alat yang akan digunakan harus disterilisasi terlebih dahulu. Demikian pula dengan bahan tanaman dan media tanam yang akan digunakan. • Bahan tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan dapat diperoleh dari daun, tunas, cabang, batang, akar, embrio, kotiledon ataupun bagian-bagian tanaman lainnya. Sterilisasi eksplan dilakukan dengan merendam eksplan dalam larutan kimia tertentu, diantaranya alkohol, NaOCl (biasanya pada pemutih pakaian), CaOCl (kaporit), HgCl2 (sublimat), serta H2O2. • Persiapan media tanaman penting diperhatikan. Media tanam yang sangat mendukung pertumbuhan eksplan haruslah mengandung sukrosa dan hara dalam konsentrasi yang cukup. Biasanya media tanam ditaruh di dalam botol-botol kaca transparan. 2. Tahap Inisiasi Kultur Tahapan ini merupakan tahap penanaman awal. Eksplan yang telah disterilisasi kemudian ditanam pada media yang telah dipersiapkan. Media yang sesuai merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kecepatan pertumbuhan pada tahap selanjutnya. Setelah penanaman selesai, botol-botol berisi eksplan disimpan di dalam ruangan tersendiri di mana suhu, kelembaban dan cahaya dapat diatur sesuai kebutuhan pertumbuhan eksplan. Tingkat sterilisasi yang tinggi harus tetap dijaga selama proses penanaman dilakukan. Selama pertumbuhan awal, tingkat kontaminasi cukup tinggi. Semakin rendahnya tingkat sterilisasi maka tingkat kontaminasi terhadap eksplan akan semakin tinggi. Kontaminasi ditandai dengan perubahan warna pada eksplan. Indikasi pertama yaitu timbulnya warna kuning pada eksplan, kemudian coklat dan selanjutnya menghitam. Awal pertumbuhan eksplan ditandai dengan terbentuknya kalus kompak pada bagian dasar eksplan. Diperlukan beberapa minggu untuk melihat perkembangan eksplan sebelum dapat dilakukan tahap selanjutnya. 3. Tahap Multiplikasi Tunas Umumnya eksplan akan membentuk akar pada minggu awal pertumbuhan, kemudian dilanjutkan dengan pertumbuhan tunas-tunas. Tunas-tunas tersebut selanjutnya dipisahkan untuk mendapatkan tanaman baru lagi. Multiplikasi tunas dapat dilakukan dengan memisahkan ujung tunas yang sudah ada yang telah menghasilkan ruas dan buku baru; tunas-tunas lateral; tunas adventif; serta dengan cara embrio somatik. 4. Tahap Pemanjangan Tunas, Induksi Akar dan Perkembangan Akar Tunas-tunas yang telah dipisahkan kemudian membentuk bagian-bagian tanaman lengkap, termasuk bagian perakaran. Tahapan ini tidak berlaku terhadap tanaman yang mudah berakar. Induksi akar merupakan proses memicu pertumbuhan akar yang biasanya dilakukan dengan penambahan zat pengatur tumbuh terutama dari golongan auxin. Planlet akan dipindahkan ke media yang mengandung zat pengatur tumbuh. 5. Aklimatisasi Tahap akhir dari teknik kultur jaringan ini adalah aklimatisasi. Aklimatisasi merupakan tahap pemindahan plantlet dari ruang tumbuh awal ke lingkungan. Atau dengan kata lain pemindahan plantlet dari kondisi terkontrol di dalam botol ke lingkungan luar. Kondisi luar yang tidak stabil sangat rentan bagi plantlet-plantlet. Oleh karena itu, plantlet tidak langsung dipindahkan ke lapangan melainkan ke tempat-tempat persemaian atau di rumah kaca. Kondisi lingkungan terutama suhu dan kelembaban sedikit demi sedikit diubah hingga menyamai dengan kondisi di lapangan. Hal ini perlu dilakukan agar plantlet-plantlet dapat menyesuaikan kondisi lingkungannya sampai nanti dipindahkan ke lingkungan tumbuhnya seperti semula. L. Faktor yang Mempengaruhi Proses Regenerasi o Bentuk Regenerasi dalam Kultur In Vitro: pucuk aksilar, pucuk adventif, embrio somatik, pembentukan protocorm like bodies, dll o Eksplan Merupakan bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan tanaman. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas, umur eksplan, letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat digunakan sebagi eksplan adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil, endosperm, ovari muda, anther, embrio, dll. o Media Tumbuh. Di dalam media tumbuh mengandung komposisi garam anorganik, zat pengatur tumbuh, dan bentuk fisik media. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan, antara lain: Murashige dan Skoog (MS), Woody Plant Medium (WPM), Knop, Knudson-C, Anderson dll. Media yang sering digunakan secara luas adalah MS. o Zat Pengatur Tumbuh Tanaman o Faktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan ZPT adalah konsentrasi, urutan penggunaan dan periode masa induksi dalam kultur tertentu. Jenis yang sering digunakan adalah golongan Auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA), Napthalene Acetic Acid (NAA), 2,4-D, CPA dan Indole Acetic Acid (IBA). Golongan Sitokinin seperti Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA. Golongan Gibberelin seperti GA3. Golongan zat penghambat tumbuh seperti Ancymidol, Paclobutrazol, TIBA, dan CCC. o Lingkungan Tumbuh Lingkungan tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran wadah kultur. M. Kendala dan Masalah Melakukan Kultur Jaringan Teknik kultur jaringan sampai saat ini memang belum biasa dilaksanakan oleh para petani, baru beberapa kalangan pengusaha swasta saja yang sudah mencoba melaksanakannya, karena pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman memerlukan keterampilan khusus dan harus dilatar belakangi dengan ilmu pengetahuan dasar tentang fisiologi tumbuhan, anatomi tumbuhan, biologi, kimia dan pertanian. Dengan demikian jelas akan amat sulit untuk diterima oleh kalangan petani biasa. Di samping itu, pelaksanaan teknik kultur jaringan mutlak memerlukan laboratorium khusus, walaupun dapat di usahakan secara sederhana (dalam ruang yang terbatas), namun tetap memerlukan peralatan yang memadai. Kemungkinan lain petani akan merasa enggan bekerja secara aseptik.. Pekerjaan kultur jaringan meliputi: persiapan media, isolasi bahan tanam (eksplan), sterilisasi eksplan, inokulasi eksplan, aklimatisasi dan usaha pemindahan tanaman hasil kultur jaringan ke lapang. Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius, karena setiap tahapan pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan tersendiri. Karena semua pekerjaan harus dilaksanakan secara hati-hati dan cermat serta memerlukan kesabaran yang tinggi. Biaya untuk mewujudkan perbanyakan tanaman secara in vitro ini juga sangat mahal, kecuali kita meramu medium sendiri. Bila kita terpaksa harus membeli medium yang sudah jadi (dalam kemasan) jelas akan sangat mahal, sebab medium yang sudah jadi masih harus di impor dari luar negeri. Apalagi kita harus membeli saran untuk perlakuan isolasi dan fusi protoplas, tentu biayanya akan bertambah besar. Enzim-enzim yang digunakan dalam kultur jaringan juga masih dibeli dari luar negeri seperti Jepang. Lepas semua dari kendala-kendala tersebut diatas, kita harus mengakui bahwa teknik kultur jaringan sangat bermanfaat bagi dunia ilmu pengetahuan, terutama untuk pengembangan bioteknologi. Dalam kegiatan kultur jaringan, tidak sedikit masalah-masalah yang muncul sebagai pengganggu dan bahkan menjadi penyebab tidak tercapainya tujuan kegiatan kultur yang dilakukan. Gangguan kultur secara umum dapat muncul dari bahan yang ditanam, dari lingkungan kultur, maupun dari manusianya. Permasalahan dalam kultur ada yang dapat diprediksi sebelumnya dan ada pula yang sulit diprediksi kejadiannya. Untuk yang tidak dapat diprediksi, cara mengatasinya tidak dapat secara preventif tetapi diselesaikan setelah kasus itu muncul. Adapun masalah-masalah yang terjadi dalam kultur jaringan yaitu: a) Kontaminasi Kontaminasi adalah gangguan yang sangat umum terjadi dalam kegiatan kultur jaringan. Munculnya gangguan ini bila dipahami secara mendasar adalah merupakan sesuatu yang sangat wajar sebagai konsekuensi penggunaan yang diperkaya. Fenomena kontaminasi sangat beragam, keragaman tersebut dapat dilihat dari jenis kontaminasinya (bakteri, jamur, virus, dll). Upaya mencegah terjadinya kontaminsi: • Biasakan membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur jaringan. • Yakinkan bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar. • Lakukan proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu yang longgar. b) Pencoklatan/browning Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam yang sering membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Peristiwa pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering terjadi. Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan. c) Vitrifikasi Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada kultur yang ditandai dengan: Munculnya pertumbuhan dan pertumbuhan yang tidaknormal. Tanaman yang dihasikan pendek-pendek atau kerdil. Pertrumbuhan batang cenderung ke arah penambahan diameter Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent. Pada daunnya tidak memiliki jaringan pallisade.. d) Variabilitas Genetik Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam dalam jumlah yang banyak, dan bukan sebagai upaya pemuliaan tanaman maka variasi genetik adalah kendala. Variasi genetik dapat terjadi pada kultur in vitro karena: Laju multiflikasi yang tinggi, variasi terjadi karena terjadinya sub kultur berulang yang tidak terkontrol. Variasi genetik yang paling umum terjadi pada kultur kalus dan kultur -suspensi sel, hal tersebut terjadi karena munculnya sifat instabilitas kromosom mungkin akibat teknis kultur, media atau hormon.Cara mengatasi masalah variasi genetik tentunya tidak sederhana, harus memperhatikan aspek yang dikulturkan. e) Pertumbuhan dan Perkembangan Masalah utama berkaitan dengan proses pertumbuhan adalah bila eksplan yang ditanam mengalami stagnasi, dari mulai tanam hingga kurun waktu tertentu tidak mati tetapi tidak tumbuh. Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik. Karena awal pertumbuhan eksplan akan dimulai dari sel-sel yang muda yang aktif membelah, atau dari sel-sel tua yang muda kembali. Media juag dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan, karena dari kondisi medialah suatu sel dapat atau tidak terdorong melakukan proses pembelahan dan pembesaran dirinya. Pada proses klutur jaringan yang bersifa inderict embriogenesis, tahapan pembentukan kalus harus dilanjutkan dengan mendorong induksi embriosomatik dari sel-sel kalus. Terjadinya embrio somatik dapat secara endogen atau eksogen. f) Praperlakuan Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja, pertumbuahn dan perkembangannya dlama botol saja tetapi juga sangat bisa dipengaruhi oleh persyaratan kegiatan prapelakuan. Pada kasus ini masalah akan muncul bila kegiatan prapelakuaan tidak dilakukan. Prapelakuan dilakukan umumnya untuk tujuan-tujuan tertentu, secara umum adalah dalam rangka menghilangkan hambatan. Hambatan apat berupa hambatan kemikalis, fisik, biologis. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus dimulai dari pengenalan senyawa aktif, potensi gangguan, proses reaksi dan alternatif pengelolaannya. g) Lingkungan Mikro Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering menjadi masalah. Suhu ruangan inkubator sangat menentukan optimasi pertumbuhan eksplan, suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan pada eksplan. Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman yang lain berbeda, namunddemikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya ruangan inkubator suatu ruangan laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi antara satu ruangan dengan bagian ruangan yang lainnya. Sehingga optimasi pertumbuhan tidak bisa diharapkan sama antara kultur yang satu dengan kultur yang lain. Tentang Laboratorium Tempat melakukan metode ini semua harus berada di laboratorium yang memenuhi syarat berikut: • Jauh dari polusi. • Dekat dengan tenaga listrik dan air. • Berada di daerah tinggi sehingga suhu ruangan terjaga tetap rendah. Untuk ukuran dari laboratoriumnya sendiri, tergantung dari jumlah bibit yang akan dihasilkan. Sebagai patokan, untuk laboratorium seluas 250 m2, bisa menjadi tempat untuk produksi bibit sebanyak 400 ribu hingga 500 ribu bibit, yang akan mengisi lahan seluas 500-800 ha. Laboratorium tersebut juga harus mempunyai gudang penyimpanan bahan, ruang untuk membuat media, ruang tanam, ruangan inkubasi, dan rumah kaca.